雞白血病診斷方法比較與研發(fā)新思路

　　雞白血病診斷方法比較與研發(fā)新思路

　　劉會(huì)芳（石家莊市神九畜禽疾病防治及藥物研究所）

　　劉興林 陳桂清（河北省泊頭市農(nóng)業(yè)局 ）

　　雞白血病特別是J亞型白血病（俗稱(chēng)血管瘤）在我國(guó)的快速傳播，給養(yǎng)雞業(yè)造成了極大的損害，對(duì)全國(guó)的雞育種體系建設(shè)也形成了巨大的威脅。客觀(guān)形勢(shì)的發(fā)展使得廣大種雞場(chǎng)對(duì)白血病的診斷特別是快速診斷工作提出了很高很迫切的要求。今結(jié)合種雞場(chǎng)的生產(chǎn)實(shí)際，就雞白血病的有關(guān)診斷方法進(jìn)行評(píng)述，并對(duì)白血病快速診斷產(chǎn)品研發(fā)提出一些新的思路，以供參考，以求引玉。

　　1 現(xiàn)在的診斷方法

　　現(xiàn)在雞白血病的診斷方法主要有以下幾種：一是病毒分離法；二是組織病理診斷法，目前已有很好的單克隆抗體免疫組化染色法；三是血清學(xué)診斷，目前主要的是ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）法；四是PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）法。

　　1.1 病毒分離鑒定法

　　分離各亞型白血病病毒是很基礎(chǔ)性的工作，也是確診的重要手段。對(duì)于研究病毒的各種特性、機(jī)理和研發(fā)相關(guān)疫苗與藥物等都具有很重要的意義。對(duì)于自國(guó)外引進(jìn)種雞的國(guó)家來(lái)說(shuō)，一旦暴發(fā)白血病，其病毒的分離工作，對(duì)于追查病毒的來(lái)源具有特別重要的意義。

　　分離白血病病毒大體需要以下幾個(gè)步驟：一是制備雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），有時(shí)為了排除內(nèi)源性病毒的干擾，需制備對(duì)內(nèi)源性病毒有抵抗作用的細(xì)胞或細(xì)胞系；二是病料的處理和接種；三是病毒的檢測(cè)。

　　這種方法對(duì)診斷來(lái)說(shuō)，結(jié)果最確切。不利之處，一是時(shí)間長(zhǎng)，一般需要十幾天甚至更長(zhǎng)的時(shí)間；二是需專(zhuān)業(yè)設(shè)備、專(zhuān)業(yè)人員、專(zhuān)門(mén)試劑材料等；三是成本很高，成功率不太高。本方法單對(duì)診斷來(lái)說(shuō)，并不是好的選擇。一般實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有這個(gè)能力，絕大多數(shù)種雞場(chǎng)也不具備應(yīng)用能力。

　　1.2 組織病理診斷法

　　常用的方法是對(duì)HE（蘇木精—伊紅）染色切片進(jìn)行顯微觀(guān)察。觀(guān)察特征性的腫瘤細(xì)胞、腫瘤結(jié)節(jié)及細(xì)胞核與細(xì)胞漿變化。目前已大量使用的方法是，利用白血病病毒的特殊單克隆抗體使用細(xì)胞免疫組化染色法進(jìn)行檢測(cè)，這種方法可以直接確定各種組織中的腫瘤細(xì)胞病變與何種白血病病毒的關(guān)系，是一種很確切的方法。還有進(jìn)一步利用組織芯片與免疫組化染色相結(jié)合來(lái)檢測(cè)的方法。

　　還有一種方法就是間接熒光抗體法（IFA），就是用單抗或單因子血清和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗小鼠或抗雞Ig抗體做間接熒光試驗(yàn)，在熒光顯微鏡下觀(guān)察有關(guān)呈病毒特異性熒光的細(xì)胞。這也是一種結(jié)果較確切的方法。

　　這些方法需要專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)室、專(zhuān)門(mén)的設(shè)備器材及專(zhuān)業(yè)的人員，帶有很強(qiáng)的科研性質(zhì)，大多種雞場(chǎng)無(wú)法做這些工作，而且對(duì)種雞的（提前）凈化來(lái)說(shuō)有嚴(yán)重的滯后性（腫瘤早已形成），在種雞場(chǎng)實(shí)際生產(chǎn)中利用價(jià)值不大。

　　1.3 血清學(xué)診斷

　　國(guó)外在上世紀(jì)60年代采用禽白血病補(bǔ)反檢測(cè)方法，該方法敏感但操作復(fù)雜。我國(guó)八十年代開(kāi)始采用檢測(cè)羽髓的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP），該方法適合大面積操作，在我國(guó)種雞凈化方面曾起到很大作用。利用白血病病毒有關(guān)基因重組產(chǎn)物作抗原也能很好地對(duì)白血病抗體進(jìn)行檢測(cè)。

　　目前進(jìn)行應(yīng)用最廣泛的是ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）法。該方法既可做白血病各亞型的抗體檢測(cè)，也可做病原檢測(cè)。其使用大體過(guò)程包括樣本準(zhǔn)備、洗滌液準(zhǔn)備、具體操作、結(jié)果判定（陽(yáng)性陰性）等。ELISA商品化的產(chǎn)品多為白血病A、B、J亞型的抗體檢測(cè)和群特異型的P27抗原檢測(cè)。目前的科研發(fā)展已完全可以做出白血病各亞型的抗原檢測(cè)的產(chǎn)品。

　　ELISA檢測(cè)仍有一些未解的問(wèn)題，如抗體檢測(cè)中的雛雞早期陽(yáng)性率過(guò)高問(wèn)題，有人認(rèn)為是產(chǎn)品的適用性問(wèn)題，也有的認(rèn)為是內(nèi)源性病毒部分表達(dá)所引起的干擾，目前尚有爭(zhēng)論。另外就是檢測(cè)抗原時(shí)所出現(xiàn)的內(nèi)源性病毒的干擾問(wèn)題，一是對(duì)產(chǎn)蛋種雞可以用含內(nèi)源性病毒較少的蛋清來(lái)檢測(cè)，二是將來(lái)可以選用特殊的對(duì)白血病內(nèi)源性病毒不發(fā)生反應(yīng)的白血病病毒單克隆抗體來(lái)做產(chǎn)品檢測(cè)原料，從而在檢測(cè)中避開(kāi)內(nèi)源性病毒的干擾。

　　在種雞場(chǎng)的實(shí)際生產(chǎn)中，一少部分大型種雞場(chǎng)已開(kāi)始進(jìn)行白血病的ELISA檢測(cè)，大多數(shù)種雞企業(yè)未進(jìn)行此項(xiàng)工作。所以上游的原種雞場(chǎng)、祖代雞場(chǎng)不進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)，一旦發(fā)生白血病，疾病就會(huì)沿育種體系鏈逐級(jí)放大、肆意流行，許多下游的父母代種雞場(chǎng)和商品代養(yǎng)殖場(chǎng)損失就會(huì)甚為慘重。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，如果不進(jìn)行白血病檢測(cè)和陽(yáng)性種雞淘汰工作，一個(gè)祖代場(chǎng)的白血病感染率是0.5%左右，其下游父母代種雞場(chǎng)則為5﹪以上，再下游的商品代養(yǎng)殖場(chǎng)就會(huì)達(dá)到10%~40%。

　　造成我國(guó)育種體系中大多數(shù)上游種雞場(chǎng)對(duì)白血病不加檢測(cè)原因，一是相關(guān)試劑目前幾乎全部來(lái)自國(guó)外，價(jià)格昂貴，一些種雞場(chǎng)承擔(dān)不起；二是此方法需專(zhuān)門(mén)場(chǎng)所、專(zhuān)門(mén)設(shè)備和專(zhuān)門(mén)的人員，需要不少的投入，檢測(cè)時(shí)間也需幾個(gè)小時(shí)，做大面積的檢測(cè)所投入的人力成本也很高；三是一些企業(yè)本身對(duì)此病的檢測(cè)重視不足。解決這些問(wèn)題，一要支持和加快相關(guān)產(chǎn)品的國(guó)產(chǎn)化；二是國(guó)內(nèi)研發(fā)者要適應(yīng)產(chǎn)品的商品化要求和商業(yè)化模式，在科研產(chǎn)品的商品化和商業(yè)化操作問(wèn)題上要特別注意產(chǎn)品的靈敏度、穩(wěn)定性、有效期與持續(xù)性技術(shù)服務(wù)等問(wèn)題；三是種雞企業(yè)也要加強(qiáng)對(duì)相關(guān)疾病檢測(cè)的重視。

　　當(dāng)然，對(duì)于種禽白血病感染過(guò)多（如超過(guò)40%）的種禽場(chǎng)，也可以借鑒國(guó)外的經(jīng)驗(yàn)，提取本場(chǎng)白血病病毒做滅活苗進(jìn)行防疫，同時(shí)嚴(yán)格進(jìn)行病毒檢測(cè)，將帶毒種禽嚴(yán)格淘汰。這樣做的不利之處，是其檢測(cè)的代次要多一些。

　　1.4 PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）法

　　PCR法是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法。在白血病各亞型病毒的特定基因（gp37、gp85、P27、P12等）和全部基因的分析等方面具有基礎(chǔ)性意義。對(duì)研究病毒的演化、進(jìn)化和病毒的診斷具有重大意義。其基本過(guò)程是由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳檢測(cè)。利用PCR的檢測(cè)方式有多種，如熒光PCR、RT—PCR等。

　　PCR靈敏度高，能夠檢測(cè)到來(lái)自腫瘤組織、病毒感染的其他組織和細(xì)胞培養(yǎng)物中微量的白血病前病毒DNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT—PCR)還可以檢測(cè)白血病病毒RNA。對(duì)于內(nèi)源性病毒的干擾，可以選取特定的基因片段（如pol）做引物來(lái)避免。

　　目前PCR法是相關(guān)科研單位常用方法，個(gè)別種雞場(chǎng)也開(kāi)始使用這種方法。由于這些方法需要專(zhuān)門(mén)的試驗(yàn)室、專(zhuān)業(yè)設(shè)備和專(zhuān)業(yè)人員，成本較高且無(wú)法做現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。這種方法也不適合種雞場(chǎng)的大面積使用，一般種雞場(chǎng)也沒(méi)有能力做這些工作。

　　1.5小結(jié)

　　對(duì)一般種雞場(chǎng)來(lái)說(shuō)，沒(méi)有能力去做病毒分離和組織病理診斷，PCR法因要求較高也不易開(kāi)展，只有ELISA方法在很小范圍得到應(yīng)用。還有一個(gè)原因就是相關(guān)設(shè)備和試劑價(jià)格高，企業(yè)承擔(dān)不起也不愿接受，如ELISA法檢測(cè)一只種雞的一項(xiàng)指標(biāo)，市場(chǎng)要價(jià)在40元左右，如果一個(gè)種雞場(chǎng)養(yǎng)5萬(wàn)套種雞，做全面檢測(cè)就需要至少200萬(wàn)元，顯然種雞場(chǎng)無(wú)法接受，也承擔(dān)不起。目前種雞場(chǎng)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)品的要求有以下幾點(diǎn)：一是產(chǎn)品靈敏度高、穩(wěn)定性好；二是價(jià)格低廉，一頭份費(fèi)用在幾元以?xún)?nèi)；三是檢測(cè)快速，最好在幾分鐘內(nèi)完成；四是能現(xiàn)場(chǎng)操作，且操作步驟簡(jiǎn)單。

　　實(shí)際上，有一類(lèi)科研產(chǎn)品能夠滿(mǎn)足這些要求。那就是白血病膠體金快速診斷產(chǎn)品。這類(lèi)產(chǎn)品在將來(lái)有可能成為一種應(yīng)用廣泛的檢測(cè)手段。

　　2 白血病膠體金快速診斷試紙

　　膠體金試紙是利用抗體、抗原膠體金標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù)進(jìn)行抗原或抗體結(jié)合形成夾心免疫復(fù)合物并顯色的技術(shù)。此類(lèi)產(chǎn)品在禽流感、新城疫、法氏囊等疾病的診斷上已有很好的應(yīng)用。由于金標(biāo)技術(shù)是很成熟的技術(shù)，而白血病病毒的單克隆抗體和重組基因產(chǎn)物也有了很好的產(chǎn)品，所以白血病膠體金快速診斷試紙研發(fā)已具備很好的前提。因試紙產(chǎn)品具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便可現(xiàn)場(chǎng)操作、診斷快速、價(jià)格低廉且不需其他專(zhuān)業(yè)設(shè)備等特點(diǎn)，更容易為種雞場(chǎng)大面積使用。所以大有研發(fā)的必要。今就有關(guān)思路進(jìn)行簡(jiǎn)介，以供感興趣的科研工作者參考。

　　2.1白血病試紙研發(fā)的具體思路

　　目前制作多種亞型病毒的檢測(cè)試紙和通用試紙的條件都已具備，但據(jù)目前白血病流行特點(diǎn)來(lái)說(shuō)，以下試紙應(yīng)在研發(fā)上應(yīng)優(yōu)先考慮：

　　試紙一：普通型白血病抗原膠體金快速診斷試紙

　　檢測(cè)線(xiàn)選用P27衣殼蛋白的一株單抗， P27衣殼蛋白的另外一株單抗或多抗與膠體金相結(jié)合（標(biāo)記），質(zhì)控線(xiàn)則選相應(yīng)的二抗。這樣的試紙可以檢測(cè)所有的白血病病毒。

　　試紙二：J亞型白血病抗原膠體金快速診斷試紙

　　檢測(cè)線(xiàn)選用J亞型病毒gp85表面蛋白的一株單抗，另外一株J亞型病毒gp85表面蛋白的單抗或多抗與膠體金結(jié)合，質(zhì)控線(xiàn)則選相應(yīng)的二抗。這樣的試紙可以檢測(cè)樣本中是否有J亞型白血病病毒或檢測(cè)到的白血病病毒是否是J亞型的。

　　試紙三：普通型的白血病抗體膠體金快速診斷試紙

　　檢測(cè)線(xiàn)選用基因重組表達(dá)的P27衣殼蛋白，另一基因重組表達(dá)的P27衣殼蛋白與膠體金相結(jié)合，質(zhì)控線(xiàn)則選擇相應(yīng)的抗體或單抗，亦可實(shí)驗(yàn)選用SPA。

　　這三個(gè)試紙恰當(dāng)選用，既可檢測(cè)白血病病毒，又可檢測(cè)白血病抗體，還可以確定白血病病毒是否為J亞型的?；灸軌驖M(mǎn)足種雞場(chǎng)的檢測(cè)要求。

　　2.2關(guān)于白血病膠體金試紙的檢測(cè)質(zhì)量提高的相關(guān)技術(shù)問(wèn)題

　　目前常有的膠體金是中等顆粒的“紅金”。以此為基礎(chǔ)的產(chǎn)品，在檢測(cè)過(guò)程中常出現(xiàn)“紅霧”，從而影響檢測(cè)線(xiàn)的結(jié)果觀(guān)測(cè)。在研發(fā)出“紅金”試紙后，如果有關(guān)科研人員想進(jìn)一步提高試紙的檢測(cè)質(zhì)量，可以考慮應(yīng)用目前國(guó)外個(gè)別公司開(kāi)始使用的大顆粒“紫金”技術(shù)。以“紫金”為基礎(chǔ)的試紙?jiān)跈z測(cè)過(guò)程中不出現(xiàn)“紅霧”，從而能夠大大提高觀(guān)測(cè)的質(zhì)量。

　　只是在研發(fā)過(guò)程中要注意以下兩點(diǎn)：一是以“紅金”為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)到“紫金”處，不一定適用，要做一部分修改；二是“紅金”下的穩(wěn)定性與“紫金”下的穩(wěn)定性不同，這里的穩(wěn)定性有兩個(gè)方面要考慮，一是抗體或抗原與膠體金的結(jié)合，另一個(gè)是產(chǎn)品的有效期的問(wèn)題。