雞心包積液綜合征（安卡拉?。┎≡蛛x檢測

　　禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AV)是一種無囊膜的雙鏈DNA病毒，衣殼呈規(guī)則的20面體結構，直徑約80-110nm，可分為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ三群，其中Ⅰ群FAV有12個血清型(FAV1～12)，Ⅰ群FAV具有共同的群抗原，比較著名的病毒株有雞胚致死孤兒病毒(CELO virus)，鶴鶉支氣管炎病毒，雞包涵體肝炎病毒等，其中Ⅰ群FAV中C種FAV-4型認為是引起雞心包積液綜合征的病原。本病對3-6周齡肉仔雞易感，潛伏期短、發(fā)病快。感染雞群突然出現(xiàn)大批死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)心包積水、肝細胞有嗜堿性核內(nèi)包涵體，以及用透射電鏡在感染的肝細胞核內(nèi)觀察到有腺病毒顆粒。本實驗采取病死雞肝，心，腎臟進行病理組織學觀察，可見形狀不規(guī)則的嗜酸性或嗜堿性包涵體。同時取疑似雞心包積液綜合征病死雞的肝組織粗提DNA，設計引物對DNA進行PCR擴增和基因測序分析，同時最后接種雛雞，雛雞一周后出現(xiàn)死亡，用相同方法獲取組織DNA后進行PCR檢測，可發(fā)現(xiàn)相同條帶，表明成功建立雞心包積液綜合征(安卡拉病)病原分離檢測方法。

 

　　1、流行病學

 

　　本病主要開始發(fā)生于1-3周齡的肉雞、817、麻雞，也可見于肉種雞和蛋雞，其中以3-7周齡的雞發(fā)病較多。因首次發(fā)現(xiàn)于巴基斯坦卡拉奇靠近安卡拉的地方，故又名安卡拉病(Angrara disease)。發(fā)病雞群多于3周齡開始死亡，4-5周齡達高峰，高峰持續(xù)期4-8天，5-6周齡死亡減少。病程8-15天，死亡率達20%-80%，一般在30%左右。發(fā)病雞無明顯先兆而突然倒地，沉郁，羽毛成束，出現(xiàn)呼吸道癥狀，甩鼻、呼吸加快，排黃色稀糞，有神經(jīng)癥狀，兩腿劃空。本病主要垂直傳播，也可水平傳播。雞感染后可成為終身帶毒者，并可間歇性排毒。就腺病毒來說，已呈全國流行，但就表現(xiàn)出本病癥來說，現(xiàn)在在山東、河南、安徽、遼寧、吉林、河北、江蘇均有報道，其傳播速度和傳播面還是較大的。

 

　　2、解剖及病理組織檢測

 

　　如圖心臟部位形成淡黃色透明的心包積液，且肝臟有病理壞死現(xiàn)象。

　　采集發(fā)病活雞肝心腎組織器官，經(jīng)4%甲醛固定后制作石蠟切片，觀察病理組織學變化，主要病理組織學變化表現(xiàn)在肝臟，可見肝臟充血、出血和肝細胞脂肪變性，肝細胞核內(nèi)可見形狀不規(guī)則的嗜酸性或嗜堿性包涵體。

疑心包積液病死雞肝組織HE染色鏡檢

腎組織HE染色

心組織HE染色

　　3、病原PCR檢測

 

　　3.1　引物設計與合成

 

　　根據(jù)Genbank中Ⅰ群禽腺病毒FAV-4型(AY581297.1)六鄰體基因序列，應用Premier5.0設計FAV-4型引物(由上海生工公司合成)。

 

 

　　3.2　病原DNA的提取及PCR擴增

 

　　準備2個滅菌1.5mlEP管，每管按1：1加肝組織勻漿與滅菌ddH2O，8000r離心4分鐘收集上清液，按1：1加入分析純氯仿靜置10分鐘后8000r離心5分鐘，吸取上清液直接PCR，采用25ulPCR體系：

 

　　DNA樣本　　　　　　　　　1ul

　　10*PCR Buffer(Mg2+add)　2.5ul

　　dNTP(2.5umol/L)　　　　2ul

　　引物F/R各　　　　　　　0.5ul

　　Taq酶(5U/ul)　　　　　　0.5ul

　　滅菌ddH2O　　　　　　　　18ul

 

　　Buffer，dNTP，Taq酶均購自全式金，94℃　5min；94℃　45s變性；57℃　45s；72℃　45s，35個循環(huán)擴增；72℃延伸10min，4℃保存。反應結束后取全部PCR產(chǎn)物25ul，Trans 2000DNA marker對照，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴增片段大小。

FAV-4引物PCR擴增組織提取DNA

　　3.3 PCR產(chǎn)物序列測定

 

　　25ul體系PCR后0.8%瓊脂糖凝膠中空膠電泳，將目的條帶切膠回收后與pMD18-T載體(購自Takara公司)進行連接，連接體系：

 

　　目的條帶　　　5ul

　　solutionⅠ　　4.2ul

　　T載體　　　　0.8ul

 

　　16℃于PCR儀中連接30min，然后將連接產(chǎn)物10ul轉化進50ul的Trans1-T1感受態(tài)細胞(購自Trans)，冰浴30min后熱激90s，緊接冷敷3min，加800ulLB震蕩培養(yǎng)1h后6000r離心1min沉淀菌體，留100ul菌液涂布于Amp抗性的平板中37℃培養(yǎng)10小時，挑取單菌落接種于Amp抗性的5ml LB液體試管培養(yǎng)基后37℃震蕩培養(yǎng)過夜(220rpm/min)，然后將菌液送生工公司測序，測序結果應用DNA star軟件MegAlign的Clustal W方法與FAV-4基因進行序列比對，在送測序列中發(fā)現(xiàn)和295bp擴增目的片段一致的序列，表明于病雞肝臟成功檢測到FAV-4型腺病毒。

 

　　3.4病原接種試驗

 

　　將病理肝組織與滅菌生理鹽水勻漿攪勻后給雛雞口服0.5ml勻漿液，此后于37℃恒溫飼養(yǎng)，雛雞一周后出現(xiàn)死亡，取死亡雞肝臟組織用以上相同方法獲取組織DNA后進行PCR檢測，可發(fā)現(xiàn)相同條帶。